XXXIII Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia

XXXIII Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia 124 PCR-ASRA. Actividad anti-FXa plasmática determinada mediante ensayo cromogénico. La antitrombina plasmática se estudió mediante Western Blot empleando condiciones desnaturalizantes no reductoras que diferencian formas nativas, rotas y complejos trombina-antitrom- bina. Resultados: El estudio se realizó en 242 sujetos no relacionados con deficiencia de antitrombina (anti-FXa ≤ 80%) remitidos a nuestro servicio.Aunque en 27 los valores anti-FXa de lamuestra remitida eran normales, en todos los casos se realizó un estudiomolecular completo. Lamutación responsable de la variante Cambridge II se identificó en 12 sujetos (5%), todos con eventos trombóticos. En dos casos, lamutación se encontraba en heterocigosis compuesta con otra mutación severa de SERPINC1 y se asociaba con clínica trombótica grave. En un caso la mutación se identificó en homocigosis. En los 9 casos restantes, la mutación p.Ala412Ser en heterocigosis fue la única identificada en SERPINC1 . Llamativamente, 6 de estos casos presentaban una defi- ciencia anti-FXa transitoria (6/27 con deficiencia transitoria, 22,2%). Para explicar la razón por la que portadores de la varianteCambridge II presentaron valores anti-FXa por debajo de la normalidad, se seleccio- naron 17portadores (pacientes ymiembros de sus familias) cuyamuestra presentaba actividad anti-FXa normal y 17 sujetos sanos sin lamutación. El plasma se incubó durante 15minutos con trombina (1.2U) en presen- cia de heparina no fraccionada, evaluando la actividad anti-FXa residual. Los portadores de la varianteCambridge II tenían una actividad anti-FXa residual significativamente menor que los controles (64,3 ± 24,3% vs 84,1 ±16,5%; respectivamente, p=0,015 ) que se correlacionaba con un aumento de los niveles de forma rota de antitrombina. Conclusiones: Un 5% de las deficiencias de antitrombina son debidas a la variante Cambridge II. Este porcentaje podría ser incluso mayor dado que la mayoría de casos con deficiencia transitoria no se llegan a caracterizar molecularmente. La generación de trombina en portadores de la variante Cambrid- ge II conllevaría una mayor pérdida de formas nativas de antitrombina con la consiguiente reducción de la actividad anti-FXa residual, lo que supone un aumento del riesgo trombótico. Además, estos resultados justifican la elevada prevalencia de estamutación en los casos con defi- ciencia transitoria de antitrombina si se emplea sistemas diagnósticos anti-FXa, y aconsejan el uso de métodos moleculares cuando exista sospecha de deficiencia de antitrombina. PI15/00079; 19873/GERM/15; GATRA (Grifols). CO-135  Nuevo mecanismo de dominancia negativa en deficiencia de antitrombina. Implicaciones clínicas y bioquímicas de una mutación fundadora española que modifica el extremo c-terminal Bravo-Pérez C. 1 , Toderici M. 1 , Miñano A. 1 , Palomo A. 2 , Martínez- Menárguez J. A. 3 , Corral J. 1 , Vicente V. 1 , de la Morena-Barrio M. E. 1 1 Servicio de Hematología y Oncología Médica. Hospital General Universitario Morales Meseguer. Centro Regional de Hemodonación. Universidad de Murcia. IMIB-Arrixaca, CIBERER. Murcia. 2 Servicio de Hematología y Hemoterapia. Centro Materno-Infantil. Hospital Regional Universitario Carlos de Haya. Málaga. 3 Departamento de Biología Celular e Histología. Facultad de Medicina. Universidad de Murcia. Murcia Introducción: La deficiencia de antitrombina es la trombofilia más grave. Se ha sugerido que aquellas deficiencias que revisten mayor severidad pudieran ser producidas por mutaciones de efecto dominante negativo, cuya expresión interfiere en los niveles o la fun- ción de las moléculas silvestres. Objetivo: Caracterizar el mecanismo molecular de la deficiencia tipo I producida por la deleción c.1332-1336delAAGAG (gen SER- PINC1 , exón 7), identificada en tres miembros de una familia con trombosis pediátrica/recurrente y niveles de antitrombina del 30%, inferiores a los esperados para una mutación en heterozigosis. Métodos: La actividad anti-FXa y anti-FIIa se evaluó mediante métodos cromogénicos y la detección por western blot de complejos covalentes. Los niveles de antitrombina se determinaron por Laurell y western blot empleando diferentes condiciones electroforéticas. El gen SERPINC1 se secuenció mediante Sanger y NGS . Las formas de antitrombina silvestre y mutada (generada por mutagénesis dirigida) y el TFPI silvestre se expresaron en células HEK-EBNA . La antitrom- bina del medio extracelular se purificó mediante cromatografía de afinidad por heparina, analizando sus propiedades bioquímicas y su funcionalidad. La morfología celular y la localización intracelular de la antitrombina fueron evaluadas mediante microscopía electrónica e inmunomarcaje con oro coloidal. Las predicciones del efecto de la mutación sobre la proteína se realizaron con Swissmodel y Chime- ra. Finalmente, revisamos las deleciones/inserciones en el exón 7 de SERPINC1 identificadas en la HGMD ® y en nuestra cohorte de 242 casos con deficiencia de antitrombina. Resultados: La variante de antitrombina producida por la dele- ción c.1332-1336delAAGAG, con 17 residuos diferentes en su extre- mo C-terminal, se expresa un 80% menos que la silvestre. En condi- ciones reductoras muestra similar movilidad electroforética, pero sin agente reductor forma complejos unidos por puentes disulfuro (Figura 1A-B) . Sorprendentemente, tiene afinidad por heparina y actividad anti-FXa y anti-FIIa (Figura 1C) . Experimentos de cotransfección con la forma silvestre (AT MUT /AT WT ) y con el TFPI demostraron un efecto dominante negativo potente y específico (Figura 2) , con dilatación del retículo endoplásmico y acumulación en las célulasAT MUT /AT WT . Las predicciones in silico sugieren que la variante de antitrombina presen- taría dificultades para la formación del puente disulfuro C-terminal (Figura 3) . Esta mutación se identificó en cuatro casos adicionales no relacionados, todos españoles. Asimismo, se han descrito un total de 21 pequeñas deleciones/inserciones en el exón 7 del gen SERPINC1 patogénicas, que generan variantes de antitrombina con diferentes extremos C-terminales . Todas estas mutaciones se agrupan en un cluster flanqueado por secuencias repetitivas de ADN. Conclusiones : Demostramos un nuevo mecanismo patogénico de dominancia negativa implicado en deficiencias graves de antitrombina y destacada clínica trombótica. Nuestros resultados sugieren que el extre- mo C-terminal variante no impide un plegamiento correcto de la estruc- tura básica de las serpinas, a pesar de que aparentemente sea mediante interacciones con otra molécula. Estas formas son ineficazmente secre- tadas, pero sorprendentemente mantienen sus propiedades funcionales. La mutación parece tener origen fundacional español y pertenece a un cluster de mutaciones en el exón 7 que presentan una patogenia común, un incorrecto alineamiento del ADN por secuencias repetitivas. PI15/00079; CB15/00055 (ISCIII and FEDER); Fundación Española de Trombosis y Hemostasia, 19873/GERM/15 (Fundación Séneca) y GATRA (Grifols).