XXXIII Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia

Ponencias 69 Genética en trastornos plaquetarios hereditarios J. M.ª Bastida 1 , R. Benito 2 , J. M.ª Hernández-Sánchez 2 , K. Janusz 2 , S. Riesco 3 , J. R. González Porras 1 1 Servicio de Hematología. Hospital Universitario de Salamanca. Salamanca. 2 Unidad de Citogenética. Centro de Investigación del Cáncer. Instituto de Investigación Biomédica de Salamanca. Salamanca. 3 Servicio de Pediatría. Hospital Universitario de Salamanca. Salamanca Introducción Los trastornos plaquetarios hereditarios (TPH) son patologías hemorrágicas producidas por la disminución del número/formación plaquetaria (trombocitopenias hereditarias o TH), por alteraciones en su función (trombopatías hereditarias o TFPH) o por un mecanismo combinado (1). Es bien sabido, que estos pacientes suponen un reto diagnóstico al ser unos trastornos heterogéneos, con múltiples genes implicados en el desarrollo de la enfermedad que pueden dar lugar a fenotipos clínicos y de laboratorio muy diversos, pero a la vez coincidentes (2,3). La historia clínica y los antecedentes familiares son fundamentales para establecer la sospecha diagnóstica. Una vez descartado la enfermedad de vonWillebrand y/u otros defectos en la coagulación es necesario realizar pruebas de laboratorio de menor a mayor complejidad, por ejemplo, un frotis de sangre periférica, pruebas de función plaquetaria, citometría de flujo y microscopía electrónica entre otras (2,3). Todo ello va encaminado a identificar un fenotipo específico que nos permita secuenciar el gen candidato y por tanto confirmar el diagnóstico, como ocurre sobre todo, en pacientes graves mejor caracterizados como el síndrome de Bernard Soulier (SBS), la trombastenia de Glanzmann (TG) o el síndrome de Hermansky-Pudlak (SHP). Sin embargo, en numerosas ocasiones, es muy complejo poder identificar el fenotipo del paciente y por tanto la alteración molecular subyacente. En la mayoría de los TPH, la identificación de las características clínicas y de laboratorio suponen un reto en la práctica diaria, incluso hasta en centros de referencia (2,3). Además, con los algoritmos diagnósticos propuestos hasta la fecha podemos caracterizar totalmente el 40-50% de estos trastornos (4,5). Todo ello resulta en una complejidad diagnóstica evidente. Historia Los estudios moleculares son la única prueba que permite confirmar el diagnóstico de los trastornos hereditarios y facilita el consejo genético. Además, ayuda en la identificación de los subtipos que precisen diferentes estrategias terapéuticas. La técnica clásica es la secuenciación del gen candidato mediante secuenciación convencional (Sanger) (2,5). La secuen- ciación convencional ha permitido alcanzar hitos tan relevan- tes para la Genética Humana como la secuenciación del primer genoma humano en el año 2001 o la caracterización del primer haplotipo humano por el consorcio HapMap (6,7). Esta técnica detecta variantes genéticas de pequeño tamaño, realizando de 96 a 384 reacciones en paralelo, lo que conlleva un incremento en el tiempo y repercute en el incremento del precio por base secuenciada (8). Por otra parte, los mapas genéticos mediante el análisis de ligamiento ( linkage analysis ) y la utilización de marcadores micro- satélites en familias consanguíneas detectan la relación lineal entre genes localizados en un mismo cromosoma para estudiar la segre- gación de un carácter. Sin embargo, estas técnicas no permiten la detección de nuevas variantes patogénicas. Los estudios de aso- ciación genómica (Genome-Wide Association Studies o GWAS) son capaces de identificar la localización cromosómica de genes potencialmente candidatos, en aquellas familias con numerosos miembros afectos (8,9). Estas técnicas se centran en el análisis de pequeños grupos de genes que son seleccionados previamente sobre la base de una historia clínica y pruebas funcionales (2,3). Desde el año 2005 existe un gran avance en las técnicas mole- culares. El desarrollo de la secuenciación masiva de alto rendimien- to ( high-throughput sequencing o HTS) permite la secuenciación en paralelo de múltiples fragmentos de ADN que, a diferencia de otras técnicas de secuenciación, generan una gran cantidad de datos en un tiempo más reducido y a un coste menor y constituyen una alternativa eficaz en el diagnóstico molecular (8-10). El proyecto 1000 Genomes fue pionero en emplear esta tecnología, determi- nado la localización y frecuencias alélicas de más de 15 millones de Single Nucleotide Variants (SNVs), un millón de inserciones y deleciones y 20.000 variantes estructurales (11). Generalidades De manera general, todas las plataformas de HTS comparten las siguientes características (12,13): • Se genera una librería donde el ADN se fragmenta al azar y se unen los adaptadores específicos (index) para identificar cada muestra, posteriormente se purifican los segmentos a partir de los que se secuencian. • La amplificación de la librería (mediante PCR) se produce tras el anclaje del fragmento de ADN, a través de sus adap- tadores, a una superficie sólida como son las microesferas o directamente a la placa de secuenciación. Esos fragmentos se agrupan juntos ( clusters ) para su posterior secuenciación. • La secuenciación y la detección de las pares de bases (pb) ocurren al mismo tiempo en todas las moléculas de ADN (secuenciación masiva y paralela). • Las lecturas generadas ( reads ) son cortas y apareadas. Exis- ten dos tipos: mate-pairs de > 600 pares de bases (pb) (a partir de fragmentos conocidos de ADN) o paired-end de < 300 pb (de los cuales se secuencia el final de ambos extremos). Un aspecto importante es la denominada profundidad de lectura ( coverage ), que es el número de veces que cada base del