XXXIII Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia

XXXIII Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia 70 genoma está presente en las lecturas. Es uno de los factores determinantes para evaluar la fiabilidad del nucleótido asig- nado a esa posición del genoma. • El análisis computacional es primordial. Los datos de la secuencia generada se alinean frente a una secuencia de referencia, que es el genoma de referencia humano (GRCh37/HG19), elaborado por el Centro Nacional para la Innovación Biotecnológica (NCBI). Este paso es esen- cial, debido a que la calidad del alineamiento y del ensam- blaje respecto a la referencia evita tanto falsos positivos (secuencias alineadas incorrectamente) o falsos negativos (secuencias no alineadas). • Se requieren algoritmos probabilísticos bioinformáticos (Picard, GATK) para filtrar las variantes y programas de anotación para procesar la gran cantidad de datos genera- dos. Estos algoritmos emplean modelos bayesianos que calculan la probabilidad condicional de los nucleótidos en cada posición en función de variables como el número de lecturas y la calidad en la asignación de la base, entre otros parámetros (14). • Las variantes seleccionadas se filtran y se comparan con diferentes bases de datos ( Minor allele frequency < 1% y Exome Variant Server ) (NHLB) y los resultados obtenidos se visualizan con determinadas herramientas como Integrative Genomics Browser (IGV ). Las clasificaremos según su posi- bilidad de ser causantes de la enfermedad según las guías de práctica clínica del Colegio Americano de Genética, Genó- mica y Patología Molecular (15). Aplicaciones Esta tecnología ofrece múltiples aplicaciones como la secuen- ciación del transcriptoma completo (RNA-Seq), identificación de microRNAs, estudios de interacción proteína-DNA (ChIP-seq) o estudios de metilación. Las aplicaciones principales son las siguientes (2): • Paneles de genes: en ellos se secuencia un subconjunto limita- do de genes. Es un método rápido y barato respecto al Sanger y puede ser una aproximación diagnóstica en la rutina diaria. • Secuenciación del exoma/genoma completo ( whole-exome/ genome sequencing ): consiste en secuenciar las regiones codificantes (exoma) y/o no codificantes del genoma. Es un procedimiento útil para aquellos casos con una alta sospe- cha de un trastorno genético, en el que no se han identifica- do mutaciones en los genes candidatos. Su análisis es muy complejo por la gran cantidad de datos generados (> 4.000 variantes/paciente). Las principales limitaciones de la NGS son la dificultad para detectar inversiones, reordenamientos, grandes deleciones/inser- ciones, y/o grandes alteraciones estructurales (2,13). Además, se requiere de un análisis computacional, de algoritmos proba- bilísticos bioinformáticos (modelos bayesianos) y un sistema de análisis de filtrado de variantes genéticas para identificar aquellas potencialmente patogénicas. Es necesario la confirmación fun- cional mediante un modelo celular para definir una determinada variante como causante de una determinada enfermedad (2,8,15). Aplicación de la HTS en el diagnóstico de los TPH En los últimos años, la mejora de las técnicas de secuenciación masiva de alto rendimiento (HTS) ha mejorado sustancialmente la correcta identificación y caracterización molecular de los trastor- nos genéticos (8,9). Nuestro grupo ha empleado la utilización de paneles de genes analizados mediante HTS, no solo en hemofiliaA, B y enfermedad de vonWillebrand, sino también en el diagnóstico molecular de los trastornos raros de la coagulación. El diagnósti- co molecular se alcanzó en 101 de 102 pacientes con HA, HB y EVW, por tanto con un rendimiento del 99%, mientras que en los trastornos raros de la coagulación se identificó la variante genética causante de la enfermedad en los 20 pacientes analizados (26,27). Por otra parte, también hemos diseñado un panel de 71 genes involucrados en la etiopatogenia de los TPH, que mostraba un con- cordancia del 100% al identificar la variante genética causante de un TPH en 10 pacientes que habían sido previamente caracteriza- dos por secuenciación convencional tipo Sanger (18,19). Una vez validado, el análisis de este panel mediante HTS se ha implemen- tado prospectivamente en el diagnóstico de rutina de 80 pacientes con sospecha de TPH (20). En este estudio, 34 pacientes (42,5%) tenían un fenotipo específico de TPH (Figura 1) . El rendimiento global para identificar la alteración molecular subyacente se alcan- zó en el 70% de los casos, mejorando el 40% descrito previamente en la literatura (4,5). Esta sensibilidad se incrementó notablemen- te en el grupo de TPH con un fenotipo específico, permitiendo identificar la variante genética causante del TPH en el 90% de los casos. Sin embargo, en aquellos casos más difíciles de caracterizar, aquellos con una sospecha de TPH no englobado en una patología clara o fenotipo desconocido, el rendimiento diagnóstico alcanza Figura 1. Grupo de TPH analizados mediante HTS. Noventa pacientes no relacionados con sospecha de TPH fueron incluidos en el estudio y se clasificaron en 2 grupos: grupo de validación (10 TPH cuya alteración mole- cular se había identificado previamente por Sanger) y grupo de estudio (80 pacientes sin alteración molecular conocida).