XXXIII Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia

XXXIII Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia 150 los estudios funcionales si se pretende probar el efecto patogéni- co de la mutación. Dichos estudios se pueden abordar a nivel de RNA, analizando el efecto de las mutaciones sobre el splicing , o a nivel proteico, mediante estudios in vitro que tradicionalmente se han realizado utilizando líneas celulares heterólogas (COS7, AtT-20 y HEK293). Sin embargo, la posibilidad de obtener células endoteliales del paciente a partir de sangre periférica (BOECs) representa una valiosa alternativa, dado que este es el lugar de expresión funcional del VWF. Objetivo: Investigar el mecanismo molecular y efecto patogé- nico de mutaciones de interés en VWF mediante análisis del RNA y/o estudios funcionales in vitro utilizando BOECs. Material y métodos: Para la selección de las mutaciones se han estudiado los pacientes caracterizados a nivel fenotípico y genotípico del registro español de VWD (PCM-EVW-ES). Las BOECs y el RNA de plaquetas y leucocitos se obtienen a partir de una muestra de sangre periférica del paciente. Utilizando el RNA como molde se amplifica las regiones de interés mediante RT-PCR y se analizan por Next Generation Sequencing . Para los estudios funcionales con BOECs, el VWF se determina cuan- titativa y cualitativamente mediante ELISA y Western blot y la localización subcelular mediante microscopia de inmunofluo- rescencia. Finalmente, el procesamiento del mRNA se analiza mediante RT-PCR y los niveles de expresión mediante Real Time-PCR. Resultados: Se han analizado en profundidad las 704 variantes (237 únicas) identificadas en el PCM-EVW-ES para seleccionar aquellas que presentan un mecanismo patogénico desconocido o controvertido y/o mutaciones no descritas previamente. Además de las variantes intrónicas en regiones adyacentes a los exones, se estudian como potenciales mutaciones de splicing las missense y sinónimas. Bajo estas premisas, se han seleccionado 22 mutaciones para el estudio de la transcripción y 10 para estudios funcionales en BOECs. Paralelamente al reclutamiento de los pacientes para la obtención de BOECs, se ha optimizado el cultivo a partir de la caracterización morfológica y transcripcional de BOECs de individuos control. Hasta el momento, se ha analizado el efecto de 11 mutaciones sobre el procesamiento del mRNA en: 1 muta- ción nonsense , 5 missense , 2 intrónicas, 2 sinónimas y una indel . En 3 casos se ha podido demostrar una alteración en el splicing: c.7082-2A > G causa una deleción de los 7 nucleótidos iniciales del exón 42, c.546G > A (sinónima) una deleción del exón 6 y c.8254-5T > G una retención del intrón 50. Conclusión: Los resultados obtenidos mediante ambos abor- dajes demuestran su utilidad para el estudio funcional y trans- cripcional de las mutaciones seleccionadas del PCM-EVW-ES. Asimismo, el análisis concomitante de tránscritos de plaquetas, leucocitos y células endoteliales del paciente, junto con el estudio funcional de la proteína en BOECs, representa un nuevo enfoque para el estudio integral del mecanismo patológico de las mutacio- nes que permitirá ampliar el conocimiento de las bases moleculares y celulares de la VWD. MINECO-FIS-ISCIII (PI1201494 PI15/01643 y RD12/0042/0053). Grants Baxalta/Shire (H16-32544), Baxter BioScience (H13-000845). CIBERCV is an initiative of ISCIII co-financed by Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) a way to build Europe. Métodos de diagnóstico y marcadores CO-165  Identificación de una nueva alteración del gen SERPINC1 de difícil diagnóstico y relativamente frecuente en deficiencia de antitrombina: duplicación del exón 6 De la Morena-Barrio M. E. 1 , de la Morena-Barrio B. 1 , Padilla J. 1 , Teruel R. 1 , Asenjo S. 2 , Wypasek E. 3 , Miñano A. 4 , Vicente V. 1 , Corral J. 1 1 Servicio de Hematología y Oncología Médica. Hospital General Universitario Morales Meseguer. Centro Regional de Hemodonación. Universidad de Murcia. IMIB-Arrixaca, CIBERER. Murcia, España. 2 Servicio de Hematología. Hospital Clínico San Carlos. Madrid, España. 3 The John Paul II Hospital. Cracovia, Polonia. 4 Instituto de Cardiología. Jagiellonian University Medical College. Cracovia, Polonia Introducción : La deficiencia congénita de antitrombina es la trombofilia hereditaria más grave. Hasta el 78% de las deficien- cias son debidas a mutaciones puntuales o pequeñas deleciones/ inserciones en exones o regiones flanqueantes de SERPINC1 (el gen codificante) fácilmente detectables mediante secuenciación de Sanger. Un pequeño porcentaje (2%) se produce por grandes alteraciones del gen, principalmente deleciones, cuyo diagnóstico molecular se realiza mediante MLPA. Sin embargo, la base mole- cular de hasta el 20% de casos es desconocida. Objetivo: Identificar nuevas alteraciones moleculares en SER- PINC1 responsables de deficiencia de antitrombina. Métodos: Estudiamos 242 casos no relacionados con defi- ciencia de antitrombina. La antitrombina plasmática se caracterizó mediante ensayos funcionales (sustratos cromógenicos) y bioquí- micos (electroforesis y western blot ). El análisis genético incluyó secuenciación de Sanger y masiva (PGM, Ion Torrent), MLPA y PCR con oligonucleóticos específicos. Resultados: La secuenciación de Sanger de los 7 exones y regiones flanqueantes detectó 173 casos con mutaciones patogéni- cas. La secuenciación del gen completo identificó 5 mutaciones en regiones regulatorias. El MLPA reveló 5 casos con deleción parcial o completa del gen. Además, un total de 13 casos mostraron desordenes de N-glicosilación. El paciente P1, mujer de 42 años con trombosis venosa profunda, 75% de actividad anti-FXa, no presentaba ningún defecto molecular en SERPINC1 (Sanger, NGS y MLPA). Sin embargo, la PCR del exón 6 mostró una inserción de 193pb correspondiente a una duplicación en tándem que incluye al exón 6 (c.1154-13_1218 + 115 dup ). Los estudios familiares detec- taron dicha alteración en 5 familiares con deficiencia (60-75%). Tras reajustar ciertos parámetros se logró la detección de este defecto por MLPA. Con este ajuste se reanalizaron los 50 casos sin defecto molecular, identificando otra posible duplicación del exón 6 (P2): una mujer de 17 años con trombosis venosa profunda y 41% de antitrombina. Se diseñaron oligonucleótidos que detectan específicamente la duplicación en tándem con una PCR conven- cional. La duplicación en tándem del exón 6 en P2 era distinta a la de P1 ya que implicaba 863pb (c.1154-305_1218+493 dup ). Sin embargo, en ambos casos, se mostró la presencia de secuencias Alu flanqueando las duplicaciones. Finalmente, destacamos que