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XXXII Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
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dor Rasa3, fue casi indetectable. La variante de CalDAG-GEFI
p.S381F purificada, a diferencia de la nativa, mostró nula capa-
cidad para activar Rap1
in vitro
. En concordancia, las plaquetas
de los enfermos mostraron una reducida unión de fg a aIIbb3,
tras activación con todos los agonistas (ADP, PAR1, PAR4, CRP,
convulxina) salvo con PMA (activador directo de aIIbb3). Los
neutrófilos de los pacientes mostraron secreción (CD11b) normal,
pero una reducción relevante en la unión de fg a la b2 en células
activadas con fMLP o Mn
2+
. El modelado de las variantes p.381F
y p.296Y (Pymol) mostró una importante repercusión conforma-
cional en la estructura de CalDAG-GEFI nativa.
Conclusión:
Presentamos la mayor serie descrita hasta el
momento de anomalías congénitas funcionales de plaquetas y
neutrófilos debidas a 4 nuevas mutaciones en
RASGRP2
. La ca-
racterización de estas variantes refleja el impacto sobre la expre-
sión/función de CalDAG-GEFI y por ende sobre la capacidad de
las integrinas de estas células para activarse y unir sus ligandos
CO-161
El receptor de colágeno GPVI como posible
diana farmacológica antiplaquetaria en
infarto agudo de miocardio
Vélez P. (1), Ocaranza-Sánchez R. (2), López-Otero D. (2),
Grigorian-Shamagian L. (3), García-Acuña J. M. (2), González-
Juanatey J. R. (2), García Á. (1)
(1) Centro de Investigación en Medicina Molecular y Enfermedades Crónicas
(CIMUS). Universidade de Santiago. Santiago de Compostela, A Coruña. (2)
Servicio de Cardiología y Unidad Coronaria. Hospital Clínico Universitario de
Santiago. Santiago de Compostela, A Coruña. (3) Heart Institute. Cedars-Sinai
Medical Center. Los Angeles, USA
Introducción:
La glicoproteína VI (GPVI) es un receptor
de colágeno específico de plaquetas crítico para la formación de
trombosis arterial
in vivo.
En el presente estudio, hemos analiza-
do la vía de señalización de GPVI en plaquetas procedentes de
pacientes con infarto agudo de miocardio con elevación del seg-
mento ST (IAMCEST) y de controles con cardiopatía isquémica
crónica estable.
Objetivo:
Averiguar el grado de implicación de la vía de GPVI
en el evento agudo. En primer lugar, se aislaron plaquetas de sangre
venosa periférica y se activaron con el agonista específico de GPVI,
CRP (
collagen-related peptide
). Muestras controles y de pacientes
IAMCEST fueron comparadas mediante fosfoproteómica basada
en inmunoprecipitaciones con anticuerpos anti-fosfotirosina (la vía
de GPVI está basada en proteínas con actividad tirosina-quinasa),
SDS-PAGE en gradiente, y espectrometría de masas. Las valida-
ciones fueron mediante
western blot
en sangre periférica e intraco-
ronaria de cohortes independientes de pacientes.
Resultados:
Se identificaron 24 proteínas con distintos nive-
les de fosforilación en tirosina (pTyr) al comparar plaquetas sis-
témicas activadas con CRP procedentes de pacientes IAMCEST
y de controles crónicos, cuatro de las cuales fueron seleccionadas
para estudios de validación: PLC
ϒ
2, G6f, SLP-76, y Dok-2. Los
estudios mediante western blot demostraron que estas proteí-
nas tenían unos mayores niveles pTyr en plaquetas de pacientes
IAMCEST, siendo estos niveles más pronunciados al analizar las
plaquetas procedentes de sangre extraída de la arteria coronaria
ocluida (lugar de la oclusión). Estudios de agregación llevados a
cabo en paralelo, demostraron unos mayores niveles de agrega-
ción en respuesta a CRP y colágeno de las plaquetas procedentes
de pacientes IAMCEST respecto a los controles crónicos.
Conclusión:
En este estudio demostramos unos mayores ni-
veles de activación de la vía de GPVI en pacientes IAMCEST,
confirmando este receptor como una diana antitrombótica pro-
metedora en infarto agudo de miocardio. Actualmente estamos
tratando de identificar fármacos inhibidores de dicha diana.
Financiación: Este trabajo ha sido financiado por el MINECO y
por la SETH-FETH (Primer premio para proyectos de investigación
relacionados con trombosis y hemostasia, convocatoria 2013).
CO-162
Identificación de la filamina A como un
nuevo regulador de la entrada capacitativa
de calcio en plaquetas humanas
Bermejo Vega N. (1), Diez R. (2), Gutiérrez J. F. (2), Brull J. M. (3),
Salido Ginés M. (2), Redondo P. C. (2), Rosado J. A. (2), López J. J. (2)
(1) Departamento de Hematología. Hospital San Pedro de Alcántara. Cáceres.
(2) Departamento de Fisiología. Universidad de Extremadura. Cáceres. (3) Banco
de Sangre de Extremadura. Mérida, Badajoz
Introducción:
El ion Ca2+ y la filaminaA (FLNA) son actores
esenciales del mecanismo de agregación plaquetaria. Durante este
proceso, la fosforilación dependiente de Ca2+ de la FLNA en el
residuo Ser2152 le permite actuar como una proteína integradora
de vías de señalización al asociarse con integrinas, complejos de
receptores y segundos mensajeros
1
. Estudios recientes han mos-
trado cuadros clínicos similares en pacientes con un déficit en la
expresión de FLNA y en pacientes con Síndrome de Stormorken y
con Síndrome plaquetario de York, ambos causados por una muta-
ción de ganancia de función de STIM1, un componente esencial de
la entrada capacitativa de Ca2+ (ECC). Estos cuadros clínicos se
caracterizan por un estado preactivado de las plaquetas que causa
un déficit en la agregación plaquetaria y trombocitopenia
2,3
. En este
estudio analizamos el posible papel de la fosforilación de la FLNA
como un mecanismo integrador en la regulación de ECC.
Métodos:
El aislamiento de plaquetas se realizó a partir de con-
centrados de plaquetas donados por el Banco de Sangre de Extrema-
dura. La expresión, fosforilación y asociación de la FLNA con STIM1
se determinaron mediante inmunoprecipitación y Western Blotting.
La determinación de los cambios en la concentración de Ca2+ citosó-
lico ([Ca2+]c) se realizaron por fluorimetría usando la sonda fura-2.
Resultados:
Nuestro estudio es el primero en mostrar a la
FLNA como una proteína reguladora del mecanismo de la ECC.
El tratamiento de las plaquetas con tapsigargina, un activador
de la ECC, promueve la fosforilación de la FLNA en el residuo
Ser2152 y su asociación con STIM1. Esta asociación resultó ser
dependiente de incrementos en la [Ca2+]c, como se demuestra
tras la incubación de las plaquetas con dimetil-BAPTA. La com-
binación de técnicas de inmunoprecipitación,
western blotting
y
la determinación de [Ca2+]c con el uso de un activador (Brefel-