XXXII Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia

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XXXII Congreso Nacional de la Sociedad Española de Trombosis y Hemostasia
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Métodos: Las PMP se obtuvieron por centrifugación de con-
centrados de plaquetas caducados. Evaluamos: 1) la internaliza-
ción de PMP por plaquetas, utilizando microscopía confocal; 2) la
asociación de plaquetas con PMP y la formación de agregados
heterotípicos plaqueta-leucocito, mediante citometría de flujo; y
3) las propiedades tromboelastométricas de muestras de sangre
citratada a la cual añadimos un 30% de plaquetas lavadas que
contenían PMP. El papel del receptor TLR-4 fue explorado a tra-
vés de su inhibición con un anticuerpo específico.
Resultados: Los estudios de microscopía confocal demos-
traron la internalización de PMP por plaquetas. La citometría
mostró asociación PMP-plaquetas de forma proporcional a la
concentración de PMP utilizada, alcanzando porcentajes de aso-
ciación del 86,1 ± 6,7% respecto a las muestras no expuestas a
PMP. La incubación de las plaquetas con anti-TLR4 previa a la
exposición a PMP produjo una disminución en la internalización
de PMP (57,1 ± 7,9% vs. PMP sin anti-TLR4; p < 0,05). Por otro
lado, detectamos formación de agregados heterotípicos en las
muestras expuestas a PMP (8,4 ± 0,8% vs. 4,7 ± 1,1 % en mues-
tras sin PMP; p = 0,014); que no fue modificada en presencia
de anti-TLR4. Los estudios de tromboelastometría demostraron
que al añadir un 30% de plaquetas lavadas conteniendo PMP se
producía un aceleramiento en el tiempo de coagulación (54,6 ±
4,9 segundos vs. 62,1 ± 5,2 segundos en controles; p < 0,05), y
en el tiempo de formación de coágulo (119,6 ± 6,1 segundos vs.
79,4 ± 5,8 segundos en controles; p < 0,05). La adición de plaque-
tas lavadas con anti-TLR4 + PMP resultó en la normalización de
los parámetros dinámicos.
Conclusión: Nuestros resultados confirman la capacidad en-
docítica de las plaquetas para sus propias micropartículas pro-
coagulantes (autofagia), parcialmente mediada por mecanismos
de inmunidad innata a través del receptor TLR-4 y con posibles
implicaciones en la potenciación de la capacidad protrombótica
de las plaquetas.
Ayudas: FIS-PI13/00517, RD12/0042/0016, PIE15/00027,
2014-SGR-296.
Tratamientos
antitrombóticos
CO-165Sistemas microfluídicos con superficies
biomiméticas para la evaluación global
de la hemostasia: estudio del efecto
del apixaban
Mir Fuertes E. (1), Casals-Terré J. (2), Farre-Lladós J. (2), López-
Vílchez I. (3), Arellano-Rodrigo E. (3), Díaz-Ricart M. (3), Escolar
Albaladejo G. (3)
(1) Instituto de Investigación contra la Leucemia Josep Carreras. Barcelona,
España. (2) Servicio de Hemoterapia y Hemostasia. Hospital Clínic de Barcelona.
Centro de Diagnóstico Biomédico (CDB). Instituto de Investigaciones Biomédicas
August Pi i Sunyer (IDIBAPS). Universidad de Barcelona. Barcelona, España.
(3) Departamento de Ingeniería Mecánica. Laboratorio MicroTech. Universidad
Politécnica de Cataluña. Barcelona, España
Introducción: Las pruebas disponibles para evaluar la he-
mostasia se realizan en su mayoría en condiciones estáticas. No
existe una metodología estandarizada que tenga en cuenta el en-
torno reológico en el que se desarrollan normalmente los meca-
nismos de la hemostasia. Los sistemas de microfluídica permiten
investigar de forma simultánea diferentes condiciones experi-
mentales, proporcionando información sobre la activación global
de la hemostasia en condiciones de flujo, utilizando volúmenes de
sangre inferiores a los requeridos por los sistemas macrofluídicos
clásicos, y reduciendo el tiempo de procesado. Hemos aplicado
dos modelos microfluídicos con superficies biomiméticas para
la evaluación global de la hemostasia y su validación, a través
del estudio del efecto del anticoagulante oral directo apixaban
(APIX).
Métodos: Utilizamos dos tipos de microcámaras, un modelo
comercial (Ibitreat µslide0.6, IBIDI) y otro no comercial con dise-
ño personalizado, con menores diferencias en el ángulo de entra-
da de la sangre al microcanal. Se perfundieron alícuotas de sangre
recalcificada (6 mM CaCl2), a través de los canales biomiméticos
recubiertos con colágeno fibrilar tipo I y factor tisular, durante
5 minutos a un coeficiente de cizalladura de 800/s. Ensayamos el
efecto de distintas concentraciones de APIX (0, 10, 40 y 160 ng/
ml, esta última equivalente a la Cmax terapéutica) en ambos dis-
positivos. Analizamos la interacción de plaquetas y la formación
de fibrina sobre las superficies trombogénicas expuestas a sangre
circulante utilizando técnicas de immunofluorescencia mediante
marcaje con anticuerpos específicos.
Resultados: La incubación con APIX causó disminuciones
dosis-dependientes en la superficie cubierta por plaquetas, así
como de fibrina, alcanzando niveles de significación estadística
con 160 ng/ml (*p < 0,05 vs. control sin APIX y #p < 0,05 vs.
APIX 10 ng/ml). Los estudios de microfluídica realizados con
sangre citratada recalcificada mostraron resultados similares con
ambos dispositivos utilizados. La Tabla 1 resume los porcentajes
de superficie cubierta obtenidos con la microcámara comercial.
Conclusión: Los modelos de microfluídica explorados ofre-
cen una alternativa a los sistemas macrofluídicos clásicos, que
permite evaluar la hemostasia global en condiciones reológicas.
Las microcámaras evaluadas pueden ser también de utilidad en
la evaluación y monitorización de fármacos que interfieran la he-
mostasia, tanto a nivel de la interacción plaquetaria como a nivel
de la formación de fibrina.
Ayudas: FIS-PI13/00517, RD12/0042/0016, PIE15/00027,
2014-SGR-296.
Tabla 1
[APIX] ng/ml Plaquetas Fibrina
0 23,0 ± 3,0 43,4 ± 4,8
10 17,9 ± 0,9 42,1 ± 1,9
40 14,0 ± 5,3 23,4 ± 7,7
160 5,4 ± 2,2*# 14,1 ± 4,9*#