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Comunicaciones orales
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e incubada a 42 ºC. La actividad funcional anti-FXa se determinó
por sistemas cromogénicos y los niveles antigénicos por ELISA.
El estudio genético incluyó la secuenciación del promotor, exo-
nes y regiones flanqueantes del gen
SERPINC1
. Analizamos la
expresión recombinante en células HEK-EBNA de la forma sil-
vestre y forma mutada generada mediante mutagénesis dirigida.
Resultados:
Estudiamos una familia con dos miembros diag-
nosticados de deficiencia de antitrombina. El hijo, un varón que
sufrió un evento trombótico (TVP+TEP) espontáneo con 20 años
de edad y su madre asintomática. Ambos sujetos eran portado-
res de una mutación en heterocigosis en el exón 7 del gen
SER-
PINC1
que afectaba al residuo P1 del centro reactivo (RCL):
p.Arg393Cys (p.Arg425Cys contando el péptido señal). Los dos
portadores presentaban actividad anti-FXa reducida (54 y 51%),
deficiencia tipo II, ya que los niveles antigénicos fueron prácti-
camente normales (93 y 105%). Sorprendentemente, el estudio
electroforético en condiciones nativas mostró tres bandas reco-
nocidas por el anticuerpo anti-antitrombina. Además de la forma
nativa correspondiente al alelo silvestre, se detectaron dos bandas
adicionales de menor y mayor movilidad electroforética. El es-
tudio en SDS confirmó la presencia de un complejo covalente
unido por puentes disulfuro. La incubación tiempo dependiente
del plasma a 42 grados durante 24 horas provocó la desapari-
ción gradual de la banda de mayor movilidad electroforética en
condiciones nativas a expensas de un incremento de la banda de
menor movilidad correspondiente al complejo unido por puentes
disulfuro con la albúmina. El modelo recombinante confirmó la
deficiencia de tipo II de la mutación ya que la proteína variante
se expresaba y secretaba al medio de cultivo con niveles similares
a la proteína silvestre. Interesantemente, la suplementación del
medio de cultivo con albúmina humana permitía la formación de
un complejo con la variante unido por puentes disulfuro.
Conclusión:
Nuestro estudio demuestra que la interacción de
la antitrombina Milano, p.Arg393Cys con la albúmina median-
te puentes disulfuro se puede producir extracelularmente, en el
plasma, pero se restringe a la forma latente. La mutación en P1
desestabilizaría la forma nativa, aumentando la sensibilidad a
transformarse a forma latente. El hecho de que el residuo P1 no
forma parte de la hebra s4A en la forma latente podría justificar
que fuera accesible para la formación de un puente disulfuro con
una cisteína de la albúmina.
Financiación: PI15/00079 y CB15/00055 (ISCIII&FEDER);
19873/GERM/15 Fundación Séneca.
Plaquetas
CO-160
Caracterización de cuatro nuevas variantes
moleculares de
RASGRP2
que impiden la
activación de aIIbB3 mediada por
CalDAG-GEFI causando disfunción
plaquetaria y leucocitaria
Lozano M. L. (1,2), Bastida J. M. (3), Caparros E. (1), Barqueros
V.(1), Padilla J. (1), Sevivas T. (4), Iruin G. (5), Cid A. R. (6), Adan-
Pedroso R. (5), Coucelo M. (4), Marques D. (4), González-Porras
J. R. (3), Hernández-Rivas J. M. (3), Ferrer-Marin F. (1,2), Vicente
V. (1,2), Watson S. P. (7), Bergmeier W. (8), Rivera J.(1,2)
(1) Servicio de Hematología y Oncología Médica. Hospital Universitario Morales
Meseguer. Centro Regional de Hemodonación. Universidad de Murcia. IMIB-
Arrixaca. Murcia, España. (2) Grupo de Investigación CB15/0005. Centro de
Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Raras (CIBERER). Instituto
de Salud Carlos III (ISCIII). Madrid, España. (3) Servicio de Hematología.
IBSAL-Hospital Universitario de Salamanca. Salamanca, España. (4) Serviço
de Hematologia Clínica. Centro Hospitalar e Universitário de Coimbra, EPE.
Coimbra, Portugal. (5) Servicios de Hematología, Pediatría y Oncología Infantil.
Hospital de Cruces. Bilbao, España. (6) Unidad de Hemostasia y Trombosis.
Servicio de Hematología y Hemostasia. Hospital Universitario Politécnico de la
Fe. Valencia, España. (7) Institute of Cardiovascular Sciences. College of Medical
and Dental Sciences. University of Birmingham. Birmingham, Reino Unido (8)
Department of Pharmacology and McAllister. Heart Institute. University of North
Carolina at Chapel Hill. Chapel Hill, NC, USA
Introducción:
Defectos congénitos en proteínas clave en la
activación de aIIbb3 pueden causar disfunción plaquetaria. Cal-
DAG-GEFI, un intercambiador de nucleótidos de guanina codi-
ficado por
RASGRP2,
se expresa en plaquetas y neutrófilos y es
esencial en la activación de Rap1 y la subsiguiente activación de
integrinas. Hasta la fecha, solo se han descrito tres hermanos con
disfunción plaquetaria causada por una variante
RASGRP2.
Objetivos:
Caracterizar funcional y molecularmente 5 pa-
cientes de 4 familias no relacionadas con diátesis hemorrágica y
alteración de la agregación plaquetaria.
Material y métodos:
Los probandos eran 2 hermanos espa-
ñoles (55 y 46 años), un niño de chino (9 años) y dos niños por-
tugueses no relacionados (4 y 7 años), todos ellos con historial
hemorrágico (BS = 7, BAT-ISTH) y sospecha de trastorno plaque-
tario hereditario. Evaluamos recuentos y morfología de células
sanguíneas, funcionalidad plaquetar y de neutrófilos (PFA-100,
glicoproteínas [GPs], secreción granular, unión de fibrinógeno
[fg] por citometría de flujo, agregación, retracción de coágulo,
adhesión y extensión sobre fg). El ADN de los pacientes se amali-
zó por exoma completo (ExC) (casos españoles) o un panel NGS
de 71 genes (los 3 niños). Las mutaciones halladas se confirmaron
por Sanger. La expresión plaquetar de CalDAG-GEFI se cuantifi-
có por
Western blot
. Purificamos una variante de CalDAG-GEFI
y la forma nativa y comparamos su capacidad de activar Rap1 en
un ensayo
in vitro
con Bodipy FL GDP.
Resultados:
Los 5 pacientes mostraron recuentos y morfo-
logía plaquetaria y de neutrófilos normales, así como un patrón
de función plaquetaria semejante: expresión normal de GPs (Ib/
IX, aIIbb3, aIIb1, GPVI); PFA-100 alargados (Col-Epi > 300s);
agregación severamente disminuida en respuesta a ADP y dosis
baja colágeno, pero normal o poco reducida con otros agonistas
a dosis altas (PAR1, PAR4, CRP, Ac. Araquidónico, PMA); una
escasa afectación de la secreción de selectina-P y
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C-serotoni-
na, y de la retracción de coágulo y adhesión/extensión plaquetar.
Identificamos en los pacientes nuevas mutaciones homocigotas
en
RASGRP2:
c.337C > T (p.R113X) (hermanos españoles);
c.1142C > T (p.S381F) (niño chino) y c.706C > T (p.Q236X) o
c.887G > A p.C296Y en cada uno de los niños portugueses. La
expresión de CalDAG-GEFI, pero no la Rap1 ni la de su regula-