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Comunicaciones orales
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(CIBER-BBN). Madrid. (9) Coagulopatías Congénitas, Banco de Sangre y Tejidos.
Barcelona
Introducción:
La estrategia de
Stop Codon Readthrough
se
basa en el uso de fármacos que posibilitan ignorar la señal de
terminación prematura
(Premature Termination Codons
, PTCs)
y continuar la traducción, evitando así la generación de proteí-
nas truncadas no funcionales debidas a mutaciones
nonsense
. Los
agentes
readthrough
(RTA) se están investigando como terapia en
enfermedades monogénicas causadas por este tipo de mutaciones.
En este sentido, en hemofilia A (HA) aproximadamente el 10%
de las mutaciones puntuales descritas son mutaciones
nonsense
.
Nuestro grupo demostró la utilidad de un modelo
in vitro
, basado
en células CHO transfectadas con variantes del
F8-BDD
(
F8
con
el dominio B deleccionado) que contenían PTCs, para el análisis
del mecanismo
readthrough
en HA
.
Utilizando las ventajas de
este modelo el objetivo del estudio ha consistido en identificar
y caracterizar la acción terapéutica de varios fármacos RTA en
función del entorno molecular en el que se produce la mutación
nonsense
: triplete de parada, secuencias adyacentes y aminoácido
codificado originalmente por el triplete mutado.
Métodos:
Para ello, se han diseñado, sintetizado y anali-
zado un total de 11 construcciones del
F8-BDD
que contienen
diferentes PTCs: Q487X, Q1705X, Q1764X, W274X, W1726X,
W2015X, W2131X, R1715X, R1822X, R1960X y R2071X. Se
evaluó la respuesta a cinco RTAs (geneticina, gentamicina, ata-
luren, RTC13 y RTC14) mediante el análisis de la expresión del
mRNA del
F8
por RT-PCR, la actividad coagulante del FVIII
(FVIII:C) por ensayo cromogénico y los niveles y localización de
la proteína por
Western-Blot
e inmunofluorescencia.
Resultados:
Los resultados mostraron que todas las cons-
trucciones dan lugar a una acumulación intracelular de FVIII
truncado. Tras el tratamiento farmacológico, 5 de los 11 cultivos
transfectados con dichas variantes (Q487X, Q1764X, W274X,
W2015X, W2131X) presentaron en el sobrenadante un incre-
mento significativo en la FVIII:C. Este aumento se vio asociado
a una menor acumulación intracelular de proteína truncada y un
aumento de proteína completa. Un análisis exhaustivo del entorno
molecular en el que ocurre el PTC ha permitido establecer unos
criterios de eficacia en la respuesta a RTAs: a) el tratamiento con
RTAs es más eficiente en PTCs que presentan la secuencia con-
senso T-Stop-C; b) el tratamiento con RTAs es más eficiente en
PTCs tipo TGA (
opal
) que TAG (
amber
); c) el tratamiento con
RTAs de PTCs produce un incremento en la FVIII:C cuando el
aminoácido original mutado es triptófano (Trp = W) o glutamina
(Gln = Q); d) el tratamiento con RTAs de PTCs cuando el ami-
noácido original mutado es arginina (Arg = R), a pesar de ser efi-
ciente en la reducción intracelular de proteína truncada, dan lugar
a una proteína no funcional, sin incremento de FVIII:C.
Conclusión:
Los resultados obtenidos en este modelo pro-
porcionan una prueba de concepto según la cual los RTA son ca-
paces de rescatar la presencia de PTC con diferentes eficiencias
dependiendo del entorno molecular. Este modelo mediante una
prueba funcional basada en el incremento de la FVIII:C, permite
profundizar en el análisis de los mecanismos de acción de los
RTAs que podría suponer un beneficio futuro para pacientes he-
mofílicos.
Financiación: E-Rare-2 2011, HEMO-iPS, FIS, ISCIII
(PI11/03024, PI11/03029). Aspire Awards 2014 (Pfizer).
Métodos de diagnóstico
y marcadores
CO-152
Desarrollo de un método de metabolómica
avanzada que nos permita establecer un
perfil de metabolitos plasmáticos asociados
con riesgo de sufrir un episodio trombótico
Fernández-Pardo Á. (1), Martos L. (1), Masiá A. (2), Ramón L.
A. (1), Oto J. (1), Cid A. R. (1), Haya S. (1), Bonanad S. (1), España
F. (1), Medina P. (1), Picó Y. (2), Navarro S. (1)
(1)IIS La Fe. Hospital Universitario y Politécnico La Fe. Valencia. (2) Facultad de
Farmacia. Universidad de Valencia. Valencia
Introducción:
Cambios cualitativos y cuantitativos en el
equilibrio hemostático puede resultar en una hemorragia o una
trombosis. Mediante los estudios de trombofilia actuales no se
identifican a todos los individuos con alto riesgo de sufrir un
evento trombótico, por lo que deben existir factores de riesgo
desconocidos que pueden interactuar con los ya conocidos y ex-
plicar la enfermedad. Además, se sabe poco acerca de los fac-
tores ambientales que desencadenan la enfermedad trombótica,
y la asociación entre la exposición a contaminantes ambientales y
la incidencia trombótica es controvertida.
Objetivo:
Desarrollar un método de metabolómica avanzada
no dirigido que nos permita establecer un perfil característico de
metabolitos plasmáticos en pacientes con tromboembolismo ve-
noso (TEV).
Métodos:
Se seleccionaron muestras de plasma citratado de
10 voluntarios sanos, 10 pacientes con historia de TEV provocado
y 10 TEV no provocado. Puesto que el número de metabolitos
identificados depende del procedimiento de extracción utiliza-
do, comparamos 4 métodos de extracción de metabolitos en las
muestras de plasma: extracción en frío con metanol, acetonitrilo
o cada uno acidificado con 1 % de ácido fórmico. A continuación
todas las muestras se analizaron mediante UHPLC-QqTOF-MS
(ABSciex). El equipo se calibró cada tres muestras mediante ca-
libración externa. Puesto que en la investigación metabolómica la
etapa de desafío se produce durante la identificación de los meta-
bolitos, hemos creado una biblioteca MS/MS propia de metaboli-
tos descritos en plasma, que nos permite extraer los cromatogra-
mas de los iones correspondientes a los diferentes metabolitos,
mejorando su identificación.
Resultados:
Los mejores resultados se obtuvieron para la
extracción con metanol o acetonitrilo en frío. Los análisis me-
tabolómicos no dirigidos mediante UHPLC-QqTOF-MS fueron
analizados utilizando diferentes pruebas estadísticas, con el fin de